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【转载】 《皮肤养生学》（24）—— 第五节 评价防治皮肤过敏效果的检测方法

美容---皮肤养生学

 

第五节 评价防治皮肤过敏效果的检测方法

 

目前，关于化妆品抗过敏功效评价测定的研究还很少，仅有天然抗敏性物质抗敏性测定的研究报道。其中常见的有主观评定和半主观评定，抗过敏活性的体外检测方法主要有透明质酸酶体外抑制实验、肥大细胞组胺释放实验、β-己糖胺酶抑制实验、免疫细胞复活法以及血清中IgE抗体抑制实验等。其中。最常用的是透明质酸酶体外抑制实验。

 

1、主观评定

 

通常以问卷调查的形式进行，对敏感者的自我评定，包括患者在受各种理化因素刺激后产生的刺痛、烧灼、紧绷、瘙痒等感觉。Goffin等根据受试者对气候(寒冷及干燥)、皮肤护理品、清洁剂、纺织品及粗糙物品的敏感性分别进行评分： 0分为不敏感，1 分为稍敏感，2 分为敏感。将5 项评分相加，总分大于4分者为敏感性皮肤。

 

2、半主观评定

 

敏感性皮肤所引起的感觉刺激是难以定性、定量的，并且通常没有可见的伴随症状发生，仅用问卷调查这种方式进行对敏感性皮肤评定，主观因素过多。因此，需要相对客观的方法进行评定。刺激试验，作为一种半主观的方法目前已经被广泛的用于敏感性皮肤的判定，主要的方法有以下几种：

 

①十二烷基硫酸钠( SDS)试验：是运用非常广泛的一种方法。SDS可以调节皮肤表皮的张力，增加皮肤血流量，增加皮肤表面通透性。它作为一种原始的刺激物，通过细胞毒作用直接损伤皮肤。测试方法是将1. 0% SDS置于直径为12 mm的Finn小室于前臂屈侧进行封闭斑贴试验，24h后除去斑试物，分别于24、48、96 h观察结果，进行4 分法评分( 0 分为无刺痛，1分为轻度刺痛，2 分为中度刺痛，3分为重度刺痛)，取其平均值，分数越高则皮肤敏感性越高。

 

②乳酸刺激试验：在敏感性皮肤的筛选中，乳酸刺激试验是运用最广泛的方法之一。测试方法分为涂抹法和桑拿法两种。涂抹法是在室温下将10%的乳酸涂抹在鼻唇沟与任意一侧脸颊。桑拿法是先用桑拿器蒸脸15min，然后用5%的乳酸涂抹在鼻唇沟与任意一侧脸颊。在2.5min及5min时对受试者的敏感性进行4分法评定。然后将两次得分相加，分数大于3者为敏感性皮肤。这种评定分法看上去似乎主观性很强，但其结果与实际情况很相似，且具有很强的可重复性。

 

③此外，还可运用氯仿-甲醇混合试验、二甲基亚砜试验、乙酰胺试验等刺激试验对敏感性皮肤进行判定。

 

3、动物实验和斑贴实验

 

化妆品开发阶段对于原料及产品致敏性的检验非常重要，通过致敏实验可以预测人们反复接触受试物时可能造成的伤害，即而可以阻止和减少这种危害。皮肤致敏实验一般以动物为受试对象，也可由人进行激发斑贴实验。动物一般选用豚鼠，实验组不少于20只，对照组不少于10只。在动物第一次接触受试物后至少一周，进行受试物激发接触，24-48小时后观察皮肤反应。实验应设阴性对照组和阳性对照组，阳性对照物可用2，4-二硝基氯代苯，皮肤反应强度按照红斑和水肿形成从无到严重各划分4-5个级别，见表5-2。

 

表5-7 动物试验皮肤不良反应分级标准

 

皮肤反应

积      分

 红斑和焦痂形成

 

   无红斑

0

   轻微红斑（勉强可见）

1

   明显红斑（散在或小块红斑）

2

   中度~重度红斑

3

   严重红斑（紫红色）至轻微焦痂形成

4

 水肿形成

 

   无水肿

0

   轻微水肿（勉强可见）

1

   中度水肿（皮肤隆起轮廓清楚）

2

   重度水肿（皮肤隆起约1mm或超过1mm）

3

最高积分

7

 

当受试物组动物出现皮肤反应积分≥2时，判为该动物出现皮肤变态反应阳性。

 

人体斑贴实验选择18-60岁符合要求的志愿者为受试对象，人数不得少于30人，根据化妆品类型和特点试用时间和例数不同（如育发类受试者不得少于200人，使用时间不得少于2个月），人体斑贴实验结果评价也分为5个级别从0到4，30例受试者中出现2级皮肤不良反应的人数多于2例（除臭产品斑贴试验2级反应的人数多于5例），或出现任何1例3级或3级以上皮肤不良反应时，判定受试物对人体有不良反应。

 

4、透明质酸酶抑制实验

 

透明质酸酶是过敏反应的参与者，研究表明透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，许多抗过敏药物有强抑制透明质酸酶活性的作用。Kakegewe等(1985年)报道了各种影响肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶的活性。透明质酸酶活性抑制和肥大细胞释放组胺抑制活性之间有很好的相关性。Yoo(1989年)也提出透明质酸酶参与组织发炎过程，是I型过敏反应的参与者。众多研究表明，透明质酸酶体外抑制试验可作为测定抗过敏活性的方法之一。

 

透明质酸酶能够无选择地水解透明质酸中的β-N-乙酰葡糖胺与D-葡糖醛酸盐之间的1,4-键，而得到β-N-乙酰葡糖胺，β-N-乙酰葡糖胺在碱性条件下可以与乙酰丙酮缩合生成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原与对-二甲氨基苯甲醛在浓盐酸乙醇中生色。基本反应方程式：

 

点击看大图

 

抗过敏活性以透明质酸酶抑制率为指标，透明质酸酶抑制率越大则抗过敏活性越强。

 

实验方法：取0.1mL0.25mmol/LCaCl2溶液和0.5mL透明质酸酶液37℃保温培养20min；加入处理后的样品液0.5mL，继续37℃保温培养20min；加入0.5mL透明质酸钠液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.1mL0.4mol/LNaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0mL并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定其吸光度值。抗过敏活性计算公式：

 

透明质酸酶抑制率=[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100%

 

式中：

 

A——对照溶液ABS值（用醋酸缓冲溶液代替样品溶液）

       

B——对照空白溶液ABS值（用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液）

       

C——试样溶液ABS值

       

D——试样空白溶液ABS值（用醋酸缓冲溶液代替酶液）

 

实验时先对A组试样进行450~700nm范围的波长扫描，以确定最大吸收波长，然后以去离子水作为参比，在该最大吸收波长处进行样品的ABS值测定。

 

5、血清中IgE抗体抑制实验

 

IgE是介导Ⅰ型变态反应的抗体，因此检测血清总IgE和特异性IgE对Ⅰ型变态反应的诊断和过敏原的确定很有价值。

 

5.1总IgE的测定

 

正常情况下血清IgE仅在ng/mL水平，用常规测定IgM的凝胶扩散法检测不出IgE，必须用高度敏感的放射免疫测定法及酶联免疫测定法进行检测。

 

①.    放射免疫吸附剂试验（IRST）是将抗IgE吸附到固相载体上用以检测血清IgE的方法，故又称固相放射免疫测定（SPRIA）；临床常用双抗体夹心法，多以滤纸为载体。将抗IgE抗体偶联到经溴化氟活化的滤纸上，使其与待检血清及IgE参考标准进行反应；洗涤后加入125I标记的抗人IgE，再经洗涤后测定滤纸片的放射活性，其测定值与标本中的IgE含量呈正相关。

 

②.    酶联免疫测定法测定血清IgE时也常用双抗体夹心ELISA法，操作方便，灵敏性也很高，在临床上经常应用。

 

③.    间接血凝试验用抗IgE致敏红细胞，将标本血清做系列稀释后与致敏红细胞反应。此法更加简便易行，便于普及，但灵敏性比上两法稍低。

 

血清总IgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示，1IU＝2.4ng，相当于WHO标准冻干血清制剂0.00928mg内所含的IgE量。正常人群IgE水平受环境、种族、遗传、年龄、检测方法及取样标准等因素的影响，以致各家报道的正常值相差甚远。婴儿脐带血IgE水平小于0.5IU/mL，出生后随年龄增长而逐渐升高，12岁时达成人水平。成人血清IgE水平约在20～200IU/mL之间，一般认为大于333IU/mL（800ng/mL）时为异常升高。

 

IgE升高相关的常见疾病有：过敏性哮喘、季节性过敏性鼻炎、特应性皮炎等。

 

5.2特异性IgE的测定

 

特异性IgE是指能与某种过敏原特异性结合的IgE，因此需要用纯化的变应原代替抗IgE进行检测；常用的方法仍然是放射免疫技术和酶标免疫技术。

 

①.    放射变应原吸附剂试验（radio allegro sorbent test，RAST）将纯化的变应原与固相载体结合，加入待检血清及参考对照，再与同位素标记的抗IgE抗体反应，然后测定固相的放射活性，通过标准曲线求出待检血清中特异性IgE的含量，或在标本放射活性高于正常人均数加3S时判为阳性。

 

②.    酶联免疫测定法试验原理及步骤基本同RAST，仅是最后加入酶标记的抗IgE，利用酶底物进行显色。测定结果的表示也与RAST相同。

 

RAST是目前公认的检测型变态反应的有效方法之一，具有特异性强、敏感性高、影响因素少、对患者绝对安全等优点；不但有助于过敏性的诊断，对寻找变应原也有重要价值。RAST与皮肤试验和支气管激发试验的符合率在80％左右，但不能完全代替后两种试验，因为活体试验还能反映嗜碱性粒细胞和靶细胞的反应性。

 

但是RAST也有许多缺点：费用昂贵、花费时间长、放射性同位素易过期而且污染环境、不同来源试剂盒的参比血清不同而不易相互比较、待检血清含有相同特异性IgG时可干扰正常结果。因此一般只在下列情况下才做RAST：①皮试结果难以肯定、但需提供进一步的诊断证据者；②不适宜做皮试或激发试验者，例如老年、幼儿、妊娠妇女、患有皮肤病、对变应原有严重过敏史或正服用抗过敏药物以及重病者；③观察脱敏治疗效果或研究变态反应机制。

 

ELISA法与RAST有相似的优点，而且还有独特的长处，如没有同位素污染、酶标抗体可长期保存，因此在国内应用较多。用ELISA法测试粉尘和一些花粉的结果与RAST符合率较高，且与临床也较符合，但与皮肤试验的符合率可能不够理想。

 

6、皮肤参数综合评定

 

刺激试验是基于受试者的自我感觉，因此存在主观因素，运用生物工程学仪器对敏感性皮肤的一些皮肤生理参数进行无创性测试，可以更客观的评定皮肤的敏感性，探寻敏感性皮肤在皮肤结构和功能上的改变。

 

皮肤屏障功能有两方面的功能：防止外界化学、物理或生物性有害因素的入侵；防止体内营养物质及水分的流失，TEWL 值的大小取决于角质层的完整性及皮肤屏障功能。TEWL可以灵敏的反映出皮肤损伤，TEWL增高表明皮肤屏障功能受损。皮肤敏感者TEWL显著高于皮肤不敏感者，因此认为敏感性皮肤存在皮肤屏障功能受损。

 

水分是皮肤上电容变化最大的物质，因此，当皮肤含水量变化时，电容值也会随之变化，被水分测试仪测得。敏感性皮肤者面部表皮水分含量较正常皮肤低。皮肤在受到刺激时，表皮皮肤色度分光仪可通过测量皮肤表面红斑大小来判断皮肤血流情况。Berardesca等发现敏感性皮肤与正常皮肤相比，红斑颜色最大值及红斑面积最大值显著增高。皮肤受刺激时，由于局部血流增加，局部温度升高，汗腺分泌增加，代谢加快，可引起TEWL增加，皮肤含水量减少，因此，敏感性皮肤的TEWL、表皮水分、皮肤表面红斑量等生理功能参数会发生特征性变化。检测敏感性皮肤表面pH值，发现其基础值高于正常皮肤，但差异无显著性。此外，还可运用A型超声仪测量表皮、真皮和皮下组织厚度的改变，利用硅胶复制和鳞屑测量仪评价皮肤二维或三维的表面结构，从而判断皮肤的敏感性状况。

 

 

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